卵巢癌 （Ovarian Cancer，OV） 是指发生在卵巢上皮的恶性肿瘤，且各年龄阶段的女性均可能发生^[1]。世界卫生组织国际癌症研究机构 （International Agency for Research on Cancer，IARC） 于 2020 年发布的有关全球癌症的最新数据显示，全球女性 OV 新发病例 31 万，死亡病例 21 万，发病率和死亡率均位居女性常见癌症的第八位^[2]。据统计数据，我国女性常见癌症中 OV 的发病率和病死率分别位居第三位和首位^[3]。由于早期 OV 症状无特异性，诊断时大多数患者已处于晚期^[4]。近年来研究发现，OV的发生发展与多种因素相关^[5]，而癌症相关基因在其发生过程中发挥重要作用^[6]。

随着生物信息学技术的发展，分析肿瘤发生发展过程中关键基因和蛋白水平上的改变，寻找利于癌症早期诊断和预后相关的潜在标记物成为当下的研究热点之一^[7]。本研究通过生物信息学方法并结合多个数据库，挖掘 OV 潜在的生物标记物，有利于提高OV患者的早期诊断率，降低患者的死亡率。

1 材料与方法

1.1 数据来源

GEO 数据库 （http://www.ncbi.nlm.nih. gov/geo） 收录了世界各国研究机构提交的基因表达数据库。从 GEO 数据库中筛选并下载 3 组 OV 数据集 GSE14407、GSE54388、GSE40595（见表1）。

1.2 方法

1.2.1 筛选差异基因

利用 GEO2R 在线分析工具得到 3 组数据集的差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），然后绘制韦恩图，最终筛选出OV的DEGs，筛选标准设为P<0.05且|log₂FC|>2。

1.2.2 GO和KEGG分析

Metascape数据库（https://metascape.org/gp/index. html）整合了GO、KEGG、String、UniProt等多个权威的数据资源，覆盖面广，可有效准确地对 DEGs 进行 GO 和 KEGG 分析。基因本体论 （Gene Ontology，GO） 功能注释是一种可以对基因进行分析并得出基因产物功能的研究手段。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，可以系统地分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能。利用Metascape 数据库对DEGs进行GO功能注释与KEGG通路富集分析，条件设为：P<0.05，Count≥5。

1.2.3 PPI网络与关键基因筛选

STRING 数据库 （https://string-db.org） 可以用来检索已知蛋白和预测蛋白之间的相互作用的数据库。利用STRING数据库对DEGs进行蛋白质-蛋白质相互作用 （Protien-Protein Interactions，PPI） 网络分析，然后将结果导入 Cytoscape 软件，选中 CytoHubba 插件中的 MCC 算法，最终得到关键基因。

1.2.4 生存预后和共表达分析

Kaplan-Meier Plotter （https://kmplot.com/analysis/） 数据库是一个不仅数据全，生存分析也是最权威的网站；GEPIA （http://gepia.cancer-pku.cn/） 数据库整合了目前癌症基因组学数据，可用于分析 OV 和正常组织之间的差异表达、预后和病理分期等。利用 KM-plotter 对关键基因与 OV 患者的预后进行总体生存 （Overall Survival，OS） 分析；再利用 GEPIA 数据库对 OV 患者总体生存有意义的基因进行共表达分析。

1.2.5 HPA和GEPIA数据库分析

HPA 数据库 （https://www.proteinatlas.org/） 是一个收录了正常组织、肿瘤组织与细胞的蛋白表达情况以及肿瘤患者的生存曲线。本研究利用 HPA 得到 OV关键基因免疫组织化学的结果，比较其在正常卵巢组织和 OV 病理组织中的关键基因蛋白表达情况；利用 GEPIA 中 Expression DIY 下的 Stage plot得到关键基因在OV中不同分期的表达情况。

1.2.6 TISIDB数据库分析

TISIDB （http://cis.hku.hk/TISIDB/） 数据库集成了肿瘤免疫中多种类型的数据资源，可用来分析肿瘤与免疫细胞之间的相互作用。利用 TISIDB 分析关键基因与肿瘤浸润淋巴细胞 （Tumor-Infiltrating Lymphocytes，TILs） 在OV中的表达相关性。

2 结果

2.1 差异基因

对 3 组数据集以 P<0.05 且|log₂FC|>2 为筛选条件处理后，进行火山图、韦恩图以及热图的绘制，共得到161个DEGs （见图1、图2）。

A~C：火山图；D：韦恩图。

2.2 GO和KEGG富集分析

分析结果显示，GO 功能主要与细胞对转化生长因子 β 刺激的反应、雄性性腺发育、P53类介导的 DNA 损伤反应及因信号转导造成的细胞周期阻滞、有丝分裂细胞周期的G/M转变、肝素结合、蛋白激酶结合、序列特异性 DNA 结合、钙离子结合等相关。KEGG 通路富集分析显示 DEGs 主要参与癌症途径、 P53 信号通路、补体和凝血级联、 PI3K-Akt信号通路等通路 （见图3）。

A：GO功能注释；B：KEGG通路富集分析。

2.3 PPI网络构建与关键基因的筛选

采用 STRING 在线网络分析工具分析 DEGs，将最低互动得分（Minimum Required Interaction Score） 设置为0.4，其余条件采用默认值条件下得出PPI网（见图4A），然后将结果导入Cytoscape软件，选中CytoHubba插件中的MCC算法，最终得到排名前十的基因作为本研究的关键基因 （见图4B）。

A：PPI网络；B：关键基因。

2.4 关键基因生存预后分析

利用KM-Plotter数据库对筛选出的关键基因进行总体生存分析，结果显示CCNB1、HMMR、KIAA0101、 AURKA、CEP55、ECT2和TOP2A对OV患者预后具有显著性差异 （P<0.05），其中 KIAA0101 高表达有利于患者生存预后，CCNB1等6个基因高表达不利于患者生存预后 （见图5）。对7个基因进行共表达分析，结果显示CCNB1和AURKA在OV中的表达呈高度正相关（r=0.7，P=0）（见图6）。因此，综合以上分析结果，对CCNB1和AURKA进行深入分析。

2.5 关键基因的表达分析

研究结果显示， CCNB1 和 AURKA 在 OV 中的表达量均高于正常组织，但与 OV 临床分期无显著相关性 （P>0.05）（见图7）；利用 HPA数据库提供的 CCNB1 组化抗体 （CAB003804） 和 AURKA 组化抗体 （CAB001454） 对正常卵巢组织及 OV 组织进行免疫组化实验，免疫组化实验结果显示在正常卵巢组织和OV组织中有明显的差异，其中CCNB1通过抗体免疫染色后，在正常卵巢组织中未检测到染色结果，而 OV 组织中检测到中等强度的免疫染色结果；AURKA 通过抗体染色后，在正常卵巢组织中同样未检测到染色结果，而在 OV 组织中检测到低强度的免疫染色结果 （见图7），以上结果均进一步证实了 CCNB1 和 AURKA 蛋白在 OV 组织中高表达。因此，在 OV 组织中 CCNB1 和 AURKA 在基因组水平和蛋白水平均为高表达。

A1：CCNB1 在正常组织和 OV 中的表达量；A2：CCNB1 表达与患者病理分期的关系；A3：CCNB1 在卵巢组织中的蛋白表达情况 （IHC，×50）；A4：CCNB1在OV中的蛋白表达情况 （IHC，×50）；B1：AURKA在正常组织和OV中的表达量；B2：AURKA表达与患者病理分期的关系；B3：AURKA在卵巢组织中的蛋白表达情况 （IHC，×50）；B4：AURKA在OV中的蛋白表达情况 （IHC，×50）。

2.6 关键基因与肿瘤免疫细胞浸润水平的相关性

通过 TISIDB 数据库评估了 CCNB1和 AURKA 在 OV中表达与28种肿瘤浸润淋巴细胞TILs的相关性。泛癌组织中CCNB1和AURKA表达与28种TILs之间的相关性热图 （见图8）。TISIDB数据库分析结果显示：CCNB1和AURKA基因表达水平与OV肿瘤浸润 Th2细胞、Act-CD4细胞的表达丰度呈正相关，与嗜酸性粒细胞的表达丰度呈负相关，P<0.05（见图9）。

A：CCNB1在泛癌中与TILs表达相关性热图；B：AURKA在泛癌中与TILs表达相关性热图。

A：CCNB1 在 OV 中与激活 CD4⁺ T 细胞相关性；A2：CCNB1 在 OV 中与 Th2 细胞相关性；A3：CCNB1 在 OV 中与嗜酸性粒细胞相关性； B1：AURKA在OV中与激活CD4⁺ T细胞相关性；B2：AURKA在OV中与Th2细胞相关性；B3： AURKA在OV中与嗜酸性粒细胞相关性。

3 讨论

OV作为临床上常见的一类妇科恶性肿瘤疾病，因其较高的发病率和死亡率，在威胁女性生命健康的同时也造成了较大的社会疾病负担。然而，目前对于 OV 相关癌基因的分子机制还没有明确的结论，且疾病发展隐匿，大多数患者确诊时已为晚期^[8]，即使晚期患者经积极治疗后病情得到完全缓解，仍有70%~80%会出现复发^[9]， OV的高复发率也表明了肿瘤的异质性有助于其逃避细胞毒性治疗^[10]。因此，为了有效地改善目前该疾病所处的境况，寻找高效、精准的新的生物标记物成为当下急需解决的问题。

研究共得到 161个 DEGs，其 GO功能注释显示这些基因主要富集在细胞外基质、p53 类介导的 DNA 损伤反应及细胞周期阻滞、有丝分裂细胞周期的G/M转变等过程。细胞的增殖过程有一定的调控机制，一旦丧失了调控将会导致细胞无法控制的恶性增殖，最终发展成恶性病变。此外，癌细胞的生长、浸润、转移等过程离不开癌细胞外基质的作用，由此可见，细胞外基质在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。KEGG 通路主要与 p53 信号通路、补体和凝血级联、PI3K-Akt信号通路等通路相关。据文献报道，补体既可提高机体免疫监视抑制肿瘤，亦可促进肿瘤发展^[11]，此外，PI3K-Akt 信号通路的异常同样也会导致某些癌症的发生^[12]。目前与人类肿瘤相关性最高的一种基因便是 p53，p53 基因的表达不仅能够诱导细胞的凋亡，也能够抑制细胞的生长^[13]。而 p53 通路是一个极其复杂精密的信号转导通路，其中涉及很多关键基因，它们与肿瘤的发生发展具有密切的联系，其关键基因表达或活性异常均可能导致p53通路的异常，最终导致肿瘤的发生发展^[14，15]。

研究发现，CCNB1和AURKA在OV中的表达呈高度正相关，且其高表达不利于患者生存预后。 CCNB1 是一种细胞周期蛋白，其作用于真核细胞有丝分裂周期中的 G2 /M 阶段；有研究通过提取 9 例 OV 及其癌旁组织的 mRNA 做 real-time PCR 检测，结果显示，CCNB1在 OV中高表达且不利于患者预后^[16]；Yang 等^[17] 通过免疫组织化学等实验发现，CCNB1 可通过 miR-599 调控自身表达，且其高表达会促进肿瘤细胞的恶性增殖、转移和侵袭，以上均进一步证实了 CCNB1 高表达不利于患者预后。AURKA 编码的蛋白是一种细胞周期调节的激酶，该基因可能通过作用于细胞分裂周期过程引起肿瘤的发生，据研究，AURKA 在多种常见恶性肿瘤中高表达，通过各种转录调控机制来影响肿瘤的发生^[18]；此外，Chung 等^[19] 学者发现 AURKA 的异常表达在卵巢上皮细胞的恶性增殖过程中具有重要意义。CCNB1 和 AURKA 均参与调控细胞周期，Otto 等^[20] 认为，这些细胞周期蛋白过表达可能会导致肿瘤的发生，因此 CCNB1 与 AURKA 在肿瘤中发挥的作用不容小觑。

肿瘤微环境 （Tumor Microenvironment，TME） 是肿瘤细胞赖以生存的内环境，主要由肿瘤细胞以及免疫细胞、趋化因子、细胞因子等组成^[21]，与肿瘤生长、转移、免疫逃逸等行为密切相关。TME中的 Th2 细胞是 T 淋巴细胞 （Treg） 亚群之一，当其在肿瘤患者体内处于优势的情况下，会抑制机体正常的免疫功能，癌细胞更容易逃避细胞免疫监视从而促进肿瘤发生发展。研究表明，OV 患者体内 Th2细胞的相对含量与机体免疫抑制效果之间显著正相关^[22]。CD4⁺ 是一种辅助性 T 细胞，在体液免疫和细胞免疫中均扮演着重要的角色，CD4细胞的异常不仅会引起感染性疾病、自身免疫性疾病，也会引起肿瘤的发生^[23]。此外，当机体受到病原体侵袭或者发生过敏反应时，嗜酸性粒细胞数量就会剧增，增加的细胞移行至相关部位发挥免疫作用，同时释放内容物起到杀菌作用，能够有效地降低肿瘤的发生率，对机体具有保护作用。本研究通过分析发现CCNB1和AURKA的表达与肿瘤浸润Th2细胞、 Act-CD4细胞表达丰度呈正相关，与嗜酸性粒细胞的表达丰度呈负相关，表明 CCNB1 和 AURKA 基因高表达的同时，Th2细胞和 CD4细胞的含量会相应增加，嗜酸性粒细胞含量降低，最终导致 OV 患者预后差，这与前面对 CCNB1 和 AURKA 基因表达量与 OV 患者总体生存率二者之间的关系分析结果一致。

综上，本研究利用多个数据库进行分析，得到与 OV 早期确诊和预后相关的关键基因 CCNB1 和 AURKA，为寻找 OV 潜在的生物学标志物提供重要的依据。CCNB1和AURKA作为OV发生发展过程中的关键基因与此前的相关报道结果基本一致，另外，有研究表明，AURKA的异常表达与 OV患者耐药有关^[24]，因此，也更加肯定了 CCNB1 和 AURKA 在 OV 进展中发挥的作用。此外，未来在肿瘤治疗过程中，免疫介导的抗肿瘤机制可能会占据主导地位，通过研究肿瘤发生发展过程中与免疫相关的关键基因，从免疫角度上寻找治疗肿瘤的突破点，使免疫治疗能够得到最大化利用，为癌症患者带来福音，这也正是本研究为 OV 的治疗提供的一个新方向。然而，本研究结果都是基于数据分析得出，未来仍需要大量的临床实验数据加以验证。

参考文献